Опыт 2. Получение триброманилина.
Наличие аминогруппы в бензольном ядре резко повышает подвижность атомов водорода в орто- и пара-положении. Поэтому анилин, так же как и фенол, легко бромируется при комнатной температуре даже в разбавленных водных растворах.
Описание опыта . В пробирку налить 5 мл водного раствора анилина и прибавить по каплям бромную воду. Наблюдается обесцвечивание брома и выделение осадка труднорастворимого триброманилина. Уравнение реакции получения триброманилина:
Субстратами для ферментативной реакции были сложные эфиры 4-метилмеллиферона. Измеряя флуоресценцию продукта реакции, можно было зарегистрировать ход реакции на хроматографических планшетах. Исходя из этого, органические растворители, вызывающие растворение эфиров 4-метилумбелиферона, удаляли из реакционной среды. При таком типе обнаружения зарин, соман и табун были высокотоксичными веществами, которые использовались в качестве боевых газов. Используемый метод очень чувствителен к этим соединениям.
В методе визуализации жидкостной хроматографии используется специальная, пористая, непрозрачная жидкокристаллическая жидкость. Если он помещается в поляризованный свет, он равномерно окрашен по всей его поверхности. Обнаружение вещества с использованием описанного способа состоит в том, что пластину расширенной хроматографии прижимают к жидкокристаллической фольге. Таким образом, вещества на пластине в виде пятен попадают в жидкий кристалл, структура которого превращается в изотропную жидкость. На пленке в поляризованном свете могут наблюдаться различные цветные пятна идентифицированных веществ, которые одновременно отражают хроматограмму на пластине.
Опыт 4. Диазотирование анилина.
Соли первичных ароматических аминов при действии на них азотистой кислоты образуют диазосоединения. Эта реакция носит название реакции диазотирования .
Ароматические диазосоединения могут быть двух типов: истинные диазосоединения строения Ar-N=N-X и соли диазония общей формулы X - . В солях диазония один атом азота трёхвалентный, а другой заряжен положительно и связан четырьмя ковалентными связями с атомом азота и ароматическим радикалом. Построенный таким образом ион диазония образует соль с анионом кислоты. Строение солей диазония имеют сходство их с солями аммония. Это сходство проявляется и в их свойствах. Соли диазония легко растворимы в воде. Их растворы нейтральны на лакмус.
Жидкокристаллический метод может быть использован для всех сорбентов. Тонкослойная хроматография представляет собой относительно простой способ разделения и маркировки многих, часто сложных смесей органических и биологических веществ. Методикой визуализации и идентификации отделенных веществ была слабость этого метода, но благодаря разработке многих новых методов для развития цвета отделенных компонентов улучшилась чувствительность и селективность метода, улучшилась идентификация отделенных компонентов.
Гора, Применение инструментальной тонкослойной хроматографии для экологического анализа. Крауч, Основы аналитической химии. Кислота, Тонкослойная хроматография и ферментативный анализ фосфорорганических соединений. Плюмы содержат значительные концентрации белков, которые выполняют различные биологические функции. Белки не имеют однозначно определенной молекулярной массы, потому что они представляют собой смесь разных альбумина и глобулинов.
Соли диазония имеют большое значение в органической химии, так как являются весьма реакционноспособными соединениями, с помощью которых можно получать многочисленные органические вещества.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл анилина, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и кусочек льда. Пробирку с раствором помещают в воду со людом. В полученный раствор при встряхивании по каплям добавляют 0,5 мл охлаждённого раствора нитрита натрия (NaNO 2) . Получается фенилдиазоний. Уравнения реакций:
Белки плазмы определяют с использованием реакции биурета. Кроме того, протеины и пептиды, имеющие по меньшей мере две пептидные связи, подвергаются этой реакции. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации белков. Стаканы, трубки, водонепроницаемая ручка, образец плазмы, плазма контроля говядины для медицинской биохимии, стандартный раствор белка, реагент реакции биурета. Рабочий реагент для реакции биурета.
Подготовьте растворы в маркированных трубах в соответствии с инструкциями в таблице. Смешайте содержимое пробирок и оставьте на 30 минут. при комнатной температуре для завершения реакции. Используйте светоизлучающий диод. Затем вычислите значения поглощения.
C 6 H 5 – NH 2 + HCl Cl
NaNO 2 + HCl HNO 2 + NaCl
0÷2 o C
+ -
Cl + HNO 2 Cl + 2H 2 O
Опыт 4. Получение анилина жёлтого.
Описание опыта . В пробирку налить 5 мл диметиланилина и добавить 5 мл воды. После того, как деметиланилин растворится в воде, добавить 10%-ный раствор соляной кислоты. Раствор охладить и добавить раствор из предыдущего опыта - фенилдиазоний. Затем к полученному раствору добавлять по каплям ацетат натрия до получения жёлтого осадка. Ацетат натрия добавляют для нейтрализации соляной кислоты. Уравнения реакций:
В организме это один из основных антиоксидантов. Это важно для синтеза коллагена, он также участвует в коэнзиме во многих реакциях, происходящих в организме. Помимо цитрусовых, многие из них содержатся в картофеле, перце, брокколи или капусте. Поскольку витамин С растворяется в воде, его избыток можно легко выводить из организма и нет симптомов передозировки.
Мы будем использовать метод титрования, который является основным методом объемного анализа, т.е. основан на измерении объема реагентов, потребляемых в данной реакции. К сожалению, требуется специализированное и дорогостоящее стекло, но оно расположено почти в каждой средней школе. Практически никто не использует его, потому что он не чувствует себя так или не знает, как это сделать.
N=N
N
CH 3
Cl + C 6 H 5 N(CH 3) 2
CH 3 COONa + HCl CH 3 COOH + NaCl
| ● | Какие соединения называются аминами? Какова их классификация? |
| Почему амины обладают основными свойствами? |
|
| ● | Напишите уравнения реакций взаимодействия анилина, метиламина, аммиака с хлороводородом. Каковы их общие свойства? |
| ● | Какую реакцию можно считать качественной на анилин? |
| ● | Составьте структурные формулы всех аминов состава С 5 Н 13 N (без учёта аминов циклического строения) и назовите их. Сколько среди них вторичных и третичных аминов? |
| ● | Уравнением реакции (в структурной форме) объяснить обесцвечивание бромной воды и выпадение осадка белого цвета. Назвать вещество, образующее осадок |
| ● | Напишите реакцию взаимодействия метиламина с водой. Какова среда полученного раствора? |
| ● | Что наблюдаете при добавлении соляной и серной кислот к анилину? Напишите уравнения реакций и назовите полученные продукты. |
| ● | Напишите уравнение реакции диазотирования и назовите полученный продукт. |
| ● | Почему азосоединения окрашены? Какие функциональные группы могут служить в качестве ауксохрома и хромофора? |
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №16
И жаль, потому что с ней вы можете найти много интересных и полезных вещей. Таинственный инструмент, который является бюреткой, представляет собой просто длинную пипетку с пробкой на измельчителе или тефлоне с инвертированной шкалой, т.е. ноль вверху. Как мы увидим позже, это безумие - это метод. Выпускной цилиндр можно отождествить с длинной узкой шейкой, всегда заканчивающейся разрезом. Мы должны очистить колбу химическими методами, но лучше не допускать ее загрязнения.
Витамин С - довольно сильный редуктор. В кислой среде он реагирует с окислителями в соответствии со следующей схемой. В свою очередь, раствор йода в йодиде калия является окислителем. Они реагируют с содержащимися в них полиненасыщенными ионами. Половина реакции и аскорбиновая кислота следующие.
Тема: «Белки»
Аминокислотами называются азотсодержащие органические соединения, в молекулах которых содержатся аминогруппы и карбоксильные группы.
В зависимости от взаимного расположения карбоксильной и аминогрупп различают a-, β-, γ- и т.д. аминокислоты. Например,
Чаще всего термин "аминокислота" применяют для обозначения карбоновых кислот, аминогруппа которых находится в a- положении, т.е. для a- аминокислот. Общую формулу a- аминокислот можно представить следующим образом:
Если в растворе присутствует избыток иодида калия, количество молей многоионных ионов равно числу молей йода, используемых для приготовления раствора. Поэтому очевидно, что один моль йода реагирует с одним молем аскорбиновой кислоты. Как вы уже знаете, очень хорошим и точным индикатором йода является крахмал. До тех пор, пока в растворе остается аскорбиновая кислота, она регулярно реагирует с иодом, так что крахмал не окрашивается. Когда появляется избыток йода, появляется синий. Поэтому необходимо сделать раствор йода в йодиде калия с хорошо известной концентрацией йода и добавить немного крахмала в исследуемый образец.
| H 2 N– | CH–COOH │ R |
В зависимости от природы радикала (R) – аминокислоты делятся на алифатические, ароматические и гетероциклические.
A-аминокислоты вступают друг с другом в реакцию поликонденсации, приводя к амидам кислот. Продукты такой конденсации называются пептидами. При взаимодействии двух аминокислот образуется дипептид:
Измеряя объем раствора йода, необходимый для изменения цвета, мы можем рассчитать количество аскорбиновой кислоты в образце. Это типичная процедура титрования. Решение из бюретки является титрантой. Точность анализа в значительной степени зависит от точного обозначения титранта.
Важно понимать, что химический анализ регулируется законами, отличными от «нормальной» химии, целью которых является получение ценных веществ. В обычной химии важно экономить реагенты и получать хорошие результаты при низких затратах. В химии наиболее важной является точность знака, что оправдывает использование тех методов, которые в противном случае мы считали бы расточительными. К ним относятся, в частности. Повторите один и тот же анализ повторно или вымойте бюретки стандартными решениями. Сначала это может быть странно, но вы должны привыкнуть к этому.
Образующаяся группировка -СО-NH - называется пептидной связью.
При взаимодействии дипептида с новой молекулой аминокислоты получается трипептид и т.д.
Примеры простейших аминокислот
| Представитель | Н а з в а н и е |
|||
| систематическая номенклатура | рациональная номенклатура | тривиальная номенклатура |
||
| α | 2-амино Этановая К лабораторной работе "Цветные реакции на белки"Давайте перейдем к более практичным советам. Чистота оборудования играет важную роль в анализе. Перед началом работы бюретки лучше всего налить хромат и оставить его на несколько часов, особенно если он не использовался в течение длительного времени. То же самое относится и к пипеткам, хотя здесь проблема сложнее - не очень хочется мыть их хроматом. Если все смертельно грязны, лучшим вариантом является покупка новых. Это кажется ненормальным, но это правда. После мытья посуды тщательно промойте водой, используя для последних 2-3 промывок деминерализованную или дистиллированную воду. Кислота | α-амино-уксусная кислота, гликокол | (гликокол) |
|
| α СH 3 – CH - COOH | 2-амино- пропановая кислота | α-амино-пропионовая кислота | ||
| β СH 2 - CH 2 - COOH | 3-амино- пропановая кислота Вот некоторые отличные удобства: деминерализованная вода, купленная в магазине, имеет аналитическую чистоту, поэтому вам не нужно тратить более дорогую дистиллированную воду или чудовищно дистиллированный ликеро-водочный завод. Когда вы идете на работу, подготовьте как минимум один квадратный метр места на столе. Распакуйте здесь большой лист бумаги. Во время анализа что-то часто проливается, и помещать колбы в пул не является лучшей идеей - легко заразить образец. Это дает дополнительное преимущество, заключающееся в том, что у вас всегда есть оперативная заметка под рукой. | β-амино-пропионовая кислота | β-аланин |
|
| α СH 3 -CH 2 –CH- COOH | 2-амино- Бутановая | α-амино- Масляная кислота | ||
Белки – это азотсодержащие высокомолекулярные органические вещества со сложным составом и строением молекул. Представляют собой природные полимеры (сложные полипептиды), молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединённых между собою амидной (пептидной) связью.
Тем не менее, все важные результаты хранятся в отдельном ноутбуке или ноутбуке, которые вы будете оторвать от рабочей области, чтобы вы случайно не поймали его. Также не храните книги рядом с вашим рабочим местом, если вам не нравятся цветные пятна в них.
Не переусердствуйте с экономией реагентов. Если назначенное решение покинуло бутылку, оно не должно возвращаться к ней. Исключение - это решение, оставшееся после последнего титрования, и только если оно не слишком долгое время. Также важно хранить реагенты, используемые для анализа. Они должны быть в плотных бутылках из темного стекла, где это необходимо. Избегайте хранения растворов в мерных колбах и особенно в случае сильных гидроксидов, перманганата калия и нитрата серебра. Всегда держите гидроксиды в пластиковых бутылках и других реагентах в темных стеклянных бутылках.
Это природные полипептиды с высокими значениями молекулярной массы (от 5-10 тыс. до 1 млн. и более). Они входят в состав клеток и тканей всех живых организмов и являются основной составной частью нашей пищи.
В состав белков входит углерод, водород, кислород и азот. В значительно меньшем количестве в их состав могут входить также сера, фосфор и другие элементы. Белки представляют собой весьма нестойкие соединения, что затрудняет изучение их физических и химических свойств. Конечными продуктами распада белков являются
Наш план таков: вначале нам нужно приготовить раствор йода в йодиде калия с известной концентрацией - титрантным раствором. Для этого лучше всего установить его титр, т.е. титровать его известным количеством витамина С и рассчитать титр из результата. После того, как раствор сделан, мы можем перейти к правильному анализу - титрованию по меньшей мере трех частей тестируемого продукта. По пути вам также нужно сделать решение индикатора - крахмала.
При нормальном весе мы ведем 0, 7-1 г йода. Мы протираем его небольшим раствором, содержащим около 1 г йодида калия. Цвет целого должен измениться до коричневато-красного. Лучше всего использовать воронку. Мы добавляем воду в колбу примерно на половину. Мы дрожаем, чтобы полностью растворить вещество. Мы добавляем воду к нижней части шеи, а затем добавляем к линии с водой из банки или капельницы. Когда все это будет сделано, раствор необходимо вылить в хорошо высушенную черную стеклянную бутылку.
α- аминокислоты. Молекулярная масса их очень велика.
С белками связаны все жизненные процессы. Они служат питательными веществами, регулируют обмен веществ, исполняя роль ферментов – катализаторов обмена веществ, способствуют переносу кислорода по всему организму и его поглощению, играют важную роль в функционировании нервной системы, являются механической основой мышечного сокращения, участвуют в передаче генетической информации и т.д.
В стакан емкостью 100 мл мы помещаем 1 г крахмала, затем заливаем кипящую воду. От этого шага во многом зависит точность нашей маркировки, поэтому вам нужно тщательно ее переносить. Если у нас есть аналитический баланс, мы везем около 0, 5 г витамина С на нем и записываем точный результат. Если у нас нет такого веса, вам нужно пойти в аптеку и купить витамин С 500 мг в капсулах. Поскольку могут быть некоторые колебания, лучше всего назначить встречу несколько раз, используя содержимое разных капсул.
Мы растворяем витамин из капсулы или взвешиваем в мерной колбе на 500 мл, смешиваем и добавляем к отметке. Прежде чем добавить что-нибудь к этому, мы убеждаемся, что он светлый и не застревает и не скручен. Мы также готовим отдельное блюдо для мензурок, которое мы заменим бюреткой, например, при установке нуля. Вылейте раствор из бутылки в бюретку. Используйте отдельный маленький стакан и воронку. После заливки первой порции отвинтите бюретку и положите ее в стакан. Ослабьте штекер на мгновение, чтобы не было воздуха ниже крана.
Опыт 1. Свёртывание белка при нагревании.
Свёртывание белков, т.е. денатурация – процесс утраты белком природной (нативной) конформации, сопровождающаяся обычно потерей его биологической функции. При денатурации под влиянием внешних факторов (температуры, механического воздействия, действия химических реагентов и ряда других факторов) происходит разрушение вторичной, третичной и четвертичной структур белковой макромолекулы. Первичная структура, а, следовательно, и химический состав белка не меняются. Изменяются физические свойства: снижается растворимость, способность к гидратации, теряется биологическая активность. Меняется форма белковой макромолекулы, происходит укрупнение.
Для работы служит белок куриного яйца, растворённый в воде (белок одного яйца на 150 мл воды).
Описание опыта . Небольшое количество раствора белка нагреть на горелке до кипения. Наблюдается помутнение жидкости. Полученный осадок не растворяется ни при охлаждении, ни при разбавлении водой, т.е. реакция является необратимой.
Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция
Ксантопротеиновая реакция указывает на наличие в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан). При действии концентрированной азотной кислоты происходит реакция нитрования ароматических ядер с образованием окрашенных в жёлтый цвет нитросоединений. При действии аммиака нитросоединения изомеризуются с образованием интенсивно окрашенных солеобразных продуктов.
Описание опыта . К 1 мл раствора белка добавить 5–6 капель концентрированной НNО 3 до появления белого осадка (или мути от свернувшегося под влиянием кислоты белка). При нагревании раствор и осадок окрасятся в ярко-желтый цвет (осадок почти полностью гидролизуется и растворится). Смесь охладить, добавить (осторожно, не взбалтывая) по каплям избыток концентрированного водного аммиака (или едкой щелочи) до щелочной реакции. Выпадающий сначала осадок кислотного альбумината растворится, жидкость окрасится в ярко-оранжевый цвет.
Опыт 3. Биуретовая реакция
Биуретовая реакция указывает на наличие в белке повторяющихся пептидных группировок –СО–NН–. Это подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного купороса в присутствии щёлочи. Окраска объясняется образованием комплексных соединений меди.
Описание опыта . В пробирку помещают 1 мл раствора яичного белка, 1 мл раствора гидроксида натрия и 1–2 капли раствора сульфата меди (II). Жидкость окрасится в красно-фиолетовый цвет (при малом содержании белка к его раствору в щёлочи осторожно прибавить 0,5-1 мл раствора CuSO 4 , окраска появится на границе слоёв). Уравнение реакции:
CuSO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + Cu(OH) 2 ↓
2R – CH - COOH + Cu(OH) 2 → (R- CH-COO) 2 Cu + 2H 2 O
Опыт 4. Осаждение белка солями тяжёлых металлов
Описание опыта . Берут две пробирки и помещают в них по 1 мл раствора яичного белка и медленно, при встряхивании, по каплям, добавить в одну пробирку насыщенный раствор сульфата меди (II), в другую – 20%-ный раствор ацетата свинца. Образуются осадки трудно растворимых солеобразных соединений белка. Опыт иллюстрирует применение белка как противоядие при отравлении солями тяжёлых металлов. Уравнения реакций:
2R – CH - COOH + CuSO 4 → (R- CH-COO) 2 Cu + H 2 SO 4
2R–CH-COOH + (CH 3 COO) 2 Pb→ (R-CH-COO) 2 Pb + CH 3 COOН
Опыт 4. Открытие серы в белках
Описание опыта . В пробирку наливают около 0,5 мл раствора ацетата свинца и прибавляют раствор гидроксида калия до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. В другую пробирку наливают около 2-3 мл раствора белка и приливают такой же объём полученного раствора плюмбита. Нагревают смесь до кипения в течение 2-3 минут. Появление тёмного окрашивания указывает на образование сульфита свинца. Напишите уравнения реакций.
Контрольные вопросы и упражнения:
| ● | Какие изменения происходят в структуре белка при нагревании? Меняется ли его первичная структура? |
| ● | Какие качественные реакции на белки Вы изучили? Какие структурные фрагменты белков они позволяют обнаружить |
| ● | Что происходит с белком при нагревании? Как называется этот процесс? |
| ● | Наличие каких функциональных групп, обуславливает взаимодействие белка с солями тяжёлых металлов? |
| ● | Напишите уравнение биуретовой реакции. На наличие какой группировки в белке указывает данная реакция? |
| ● | На наличие чего в белковых молекулах указывает ксантопротеиновая реакция. Напишите её уравнение. |
| ● | Аминокислота С 4 Н 9 О 2 N имеет пять структурных изомеров. Написать их структурные (сокращенные) формулы и назвать по рациональной и международной номенклатуре. |
К Л Ю Ч Е В Ы Е С Л О В А
С О Д Е Р Ж А Н И Е
| 1. | Аннотация……..………………………………………………. | 2 |
| 2. | Введение……………………………………………………….. | 3 |
| 3. | Правила работы в лаборатории органической химии и предупредительные меры против несчастных случаев…..... | |
| 4 | Вопросы для коллоквиума по технике безопасности………. | 6 |
| 5. | Лабораторная работа 1. Элементный анализ органических соединений.……………………………………........................ | |
| 6. | Углеводороды…………………………………………………. | 11 |
| 7. | Лабораторная работа №2. Предельные углеводороды…….. | 13 |
| 8. | Лабораторная работа №3. Непредельные углеводороды (алкены)…………………………… ………………………...... | |
| 9. | Лабораторная работа №4. Непредельные углеводороды (алкины) ………..………………… ………………………...... | |
| 10. | Галоидопроизводные алифатических углеводородов……… | 23 |
| 11. | Лабораторная работа 5. Синтез этилбромида…………. ….... | 24 |
| 12. | Лабораторная работа 6. Ароматические углеводороды ….... | 25 |
| 13. | Кислородосодержащие органические соединения................ | 30 |
| 14 | Лабораторная работа 7. Спирты. …………..………………... | 30 |
| 15. | Лабораторная работа 8. Фенолы…………………………....... | 35 |
| 16. | Лабораторная работа 9. Альдегиды и кетоны…..................... | 39 |
| 17. | Лабораторная работа 10. Карбоновые кислоты……………. | 42 |
| 18. | Лабораторная работа 11. Оксикислоты……………………... | 47 |
| 19. | Лабораторная работа 12. Углеводы (моносахариды)…......... | 49 |
| 20. | Лабораторная работа 13. Дисахариды и полисахариды....... | 52 |
| 21. | Лабораторная работа 14. Синтез анилина…….…………...... | 55 |
| 22. | Лабораторная работа 15. Аминосоединения.……………...... | 56 |
| 23. | Лабораторная работа 16. Белки.......................……..………... | 59 |
| 24. | Литература…………………………………………………….. | 65 |
| 25. | Ключевые слова ……………..……………………………….. | 65 |
КАЧЕСТВЕННЫЕ ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ.
Биуретовая реакция на пептидную группу (реакция Пиотровского)
Метод основан на способности пептидной группы в белках и полипептидах (-CO-NH-) образовывать в щелочной среде с ионами меди комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке.
Биуретовая реакция положительна с белками и пептидами имеющими не менее двух пептидных связей.С ди- и трипептидами она не устойчива.
Биуретовую реакцию дают небелковые вещества, содержащие не менее двух пептидных групп, например, производное мочевины - биурет NH2-CO-NH-CO-NH2, давшее название этой реакции, и некоторые другие.
В сильнощелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионами меди, образуя окрашенный биуретовый комплекс. Биуретовая реакция схематично протекает так:
R1 O H R3 O H R5
H R2 OH H R4 OH
H2N CH C N CH C N CH C N CH C N CH …
R1 OH R2 H R3 OH H R5
Енольная форма полипептида
H2N CH C N CH C N
R1O O
CH N C CH N C ONa
R5 ONa R4
Комплекс фиолетового цвета
Нингидриновая реакция на α-аминогруппу
Эта реакция обусловлена наличием в аминокислотах аминогруппы в α-положении. Белки, полипептиды и аминокислоты образуют при кипячении с нингидрином соединение синего или сине-фиолетового цвета. Нингидриновая реакция является одной из наиболее чувствительных для обнаружения α-аминогрупп.
Сущность реакции заключается в том, что а-аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию. В зависимости от среды образуются различные продукты реакции. Механизм реакции сложен, но схематично его можно изобразить следующим образом:
^ Ксантопротеиновая реакция на ароматическое кольцо аминокислот
Метод основан на способности аминокислот и аминокислотных остатков полипептидов, содержащих ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание. Ксантопротеиновая реакция характерна для фенилаланина, тирозина, триптофана, имеющих ароматическое (бензольное) кольцо. Например, в реакции с тирозином образуется динитротирозин; добавление гидроксида натрия приводит к образованию натриевой соли хиноидной структуры динитротирозина:
Тирозин Желтое нитросоединение
^
Реакция Шульце-Распайля на триптофан
Фруктоза в присутствии конц. H 2 SO 4 теряет 3 молекулы воды и превращается в оксиметилфурфурол, который образует с триптофаном окрашенные продукты конденсации. Реакцию можно проводить как с фруктозой, так и с сахарозой, при гидролитическом расщеплении которой освобождаются равные количества фруктозы и глюкозы.
^
Реакция Адамкевича на триптофан
.
При нагревании триптофан взаимодействует с глиоксиловой кислотой с образованием соединения, окрашенного в красно-фиолетовый цвет.
Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, в которой как примесь содержится глиоксиловая кислота. В качестве водоотнимающего средства используется конц. H 2 SO 4 .
^ Реакция Сакагучи на аргинин
^ Реакция Фоля на серосодержащие аминокислоты.
Известны 3 серосодержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин. В молекулах цистеина и цистина сера связана относительно слабо и легко отщепляется при щелочном гидролизе в виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфиды натрия или калия. Последние взаимодействуют с уксуснокисльм свинцом с образованием осадка сернистого свинца черного или буро-черного цвета. Реакция протекает по следующим уравнениям:
^ Реакция Паули на гистидин и тирозин
При взаимодействии сульфаниловой кислоты в среде с нитритом натрия(калия) проходит реакция диазотирования и образуется диазобензолсульфоновая кислота, которая в реакции с гистидином (или тирозином) образует комплексное соединение вишневого цвета (азокраситель).
^
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ СМЕСЕЙ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.
Белки как вещества высокомолекулярные образуют коллоидные растворы. Растворимость белков в воде определяется наличием гидрофильных групп (несущих заряд или незаряженных) в аминокислотах, входящих в состав белка. Имеют также значение наличие у молекул одноименного суммарного заряда и форма молекул (отношение длинной и короткой осей). Воздействия, влияющие на гидратацию, заряд или форму белковых молекул, изменяют и ее растворимость.
^ Высаливание белков
Высаливание - обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей (NаС1)
При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. На процесс высаливания влияет ряд факторов: гидрофильность белка, его относительная молекулярная масса, заряд, в связи с чем для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Альбумины осаждаются в насыщенном растворе, а глобулины - в полунасыщенном так как у них относительная масса больше, чем у глобулинов.
Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь растворяться после уменьшения концентрации солей путем диализа или разведения водой.
^ РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.
Денатурация белков (необратимое осаждение) сводится к разрушению структуры белка и потере им биологических свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворены в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении.
^ Осаждение белков спиртом, ацетоном.
Осаждение белков солями тяжелых металлов
Белки легко осаждаются солями металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.). образуя с ними прочные солеобразные и комплексные соединения. В отличие от высаливания солями щелочных и щелочноземельных металлов для осаждения солями тяжелых металлов требуются небольшие концентрации последних. В случае применения уксуснокислого свинца и СuSO4 избыток солей вызывает растворение образованного ими осадка. Такое растворение вызывается адсорбцией избытка ионов металла и перезарядкой белкового комплекса, вследствие чего в раствор переходит комплекс измененного белка с металлом. Благодаря тому же механизму добавление достаточного количества хлористого натрия вызывает растворение ртутного соединения белка. Белковые осадки, полученные действием солей тяжелых металлов, однако, нерастворимы в первоначальном "растворителе, т.е. в воде или слабых растворах солей.
Таким образом, осаждение белков солями тяжелых металлов следует отнести к необратимым реакциям осаждения, связанным с денатурацией белка. Осадки от солей тяжелых металлов, как правило, нерастворимы даже после удаления солей диализом или растворения водой. Свойством белков связывать тяжелые металлы пользуются в медицинской практике, употребляя белки (молоко, яйца) как противоядие при отравлении солями ртути (сулема), свинца (от недоброкачественной посуды) или меди (от окисления медной посуды), пока эти соли не успели всосаться. Реакции осаждения белков солями тяжелых металлов идут обычно полно (особенно в присутствии щелочных металлов), и ими пользуются не только для выделения белков из раствора, но и для освобождения жидкостей от белков.
^
Осаждение белков минеральными кислотами.
Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое осаждение белков из растворов. Это осаждение объясняется как явлением дегидратации белковых частиц, так и рядом других причин (например, образование комплексных солей белка с кислотами и др.). Избыток минеральной кислоты, за
исключением азотной, растворяет выпавший осадок белка.
^
Осаждение белков алкалоидными реактивами
Растворы белков могут образовывать осадки при добавлении так называемых алкалоидных реактивов. К последним относятся таннин, пикриновая кислота, некоторые другие вещества. Эта способность белков к осаждению алкалоидными реактивами объясняется наличием сходных азотистых группировок как в белках, так и в алкалоидах. Механизм осаждения алкалоидными реактивами заключается в образовании нерастворимых солеобразных соединений с азотистыми основными группами. В этом соединении белок является катионом, алкалоидный реактив - анионом. Вследствие этого осаждение белков алкалоидными реактивами необходимо проводить в кислой среде (частицы белка перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадки растворяются. Протамины и гистоны осаждаются в нейтральной среде.
^
Осаждение белков органическими кислотами
Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами. Однако разные органические кислоты неодинаково действуют на белок. ТХУ, сульфосалициловая кислота являются очень чувствительными и специфическими реактивами на белок, широко применяются с этой целью. Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в конечной концентрации 2,5-5% часто применяется для полного удаления белка из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови), т.к. ТХУ осаждает только белки, а продукты их распада остаются при этом в растворе. Это особенно важно, когда нужно определить отдельно содержание азота белка и азота более низкомолекулярных продуктов: аминокислот, мочевины и др. - так называемый "небелковый азот". В этом случае, если после осаждения белков требуется из фильтрата удалить ТХУ, то это достигается его кипячением, в результате чего ТХУ разлагается на хлороформ и угольный ангидрид, которые улетучиваются.
^
Осаждение белков при нагревании.
Почти все белки свертываются при нагревании. Температура свертывания различна для разных белков, и если одни белки коагулируют уже при 50-55°С, то некоторые из них выдерживают даже продолжительное кипячение. При свертывании белки денатурируют и переходят в нерастворимое состояние.
Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате чего белок теряет свои нативные свойства и растворимость. Реакция денатурации протекает постепенно и ускоряется с повышением температуры, поэтому слишком кратковременное нагревание может и не привести к свертыванию. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в свертывании белков при нагревании. Наиболее полная и быстрая коагуляция имеет место в изоэлектрической точке, т.е. при таком рН, когда коллоидные частицы белка теряют свой электрический заряд и становятся наименее устойчивыми в растворе. Для. большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой реакции (рН около 5). В сильно кислых растворах мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость. Подобно этому в щелочных растворах стабильность белкового коллоида обусловлена отрицательным зарядом частицы. Поэтому в сильнокислых растворах белки при нагревании могут коагулировать лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли.
^ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА.
Белки следует рассматривать как вещества, содержащие большое количество кислотных и основных групп. Кислотные группы белка происходят главным образом за счет карбоксильных групп дикарбоновых кислот. Кислую реакцию дают также фенольные, гидроксильные и сульфгидрильные группы. Щелочные, или основные, группы белка обязан аминнным, гуанидиновым и имидным группам аминокислот. На кислотно-щелочтл-ге свойства белка влияет также характер соединения остатков концевых аминокислот в белковой молекуле. Обладая одновременно кислотными и основными свойствами, белки образуют биполярные ионы.
В щелочных растворах белок играет роль аниона. При потере протона из группы -NНз, например, при действии NаОН, образуется натриевая соль белка (протеинат натрия).
В кислых растворах, наоборот, белок играет роль катиона, например, с соляной кислотой получается хлористоводородная соль (протеинхлорид).
Таким образом, фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов. Ее повышение (кислая среда) уменьшает кислотную диссоциацию белка и переводит его в катион, понижение концентрации водородных ионов, наоборот, подавляет щелочную диссоциацию и переводит белковые частицы в анионы. Однако при определенном значении рН (неодинаковым для различных белков) кислотная диссоциация белковой части становится равной щелочной - число положительных зарядов амфотерного иона.
Сравнивается с числом отрицательных зарядов и заряд в целом может стать близким или практически равным нулю. В этих условиях белок находится в изоэлектрическом состоянии и в электрическом поле не будет обнаруживать передвижение ни к катоду, ни к аноду. рН раствора, при которой белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. В этой точке белок находится почти целиком в виде амфотерных ионов, несущих равные положительный и отрицательный заряды, тогда как при других концентрациях водородных ионов у белка имеется преимущественно положительный или отрицательный заряд. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы. В этом случае отталкивание одноименно заряженных частиц, повышающее устойчивость раствора, прекращается и в качестве стабилизирующего фактора действует лишь гидратная (водная) оболочка белка. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но немного сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства у них преобладают над щелочными и в нейтральной среде они реагируют как слабые кислоты. Молекула таких белков содержит больше свободных карбоксильных групп, чем амидных, а при гидролизе дает преобладание дикарбоновых и других кисло-реагирующих групп над теми, у которых преобладают основные свойства. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче аминными группами и в своем составе содержат больше остатков диаминокислот. В нейтральном растворе они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной среде реакции.
Определение изоэлектрической точки удобно произвести на примере желатина.
| № | кол-во 0,2М р-ра | кол-во 0,1М р-ра | рН | добавление 1% | добавлено | степень |
| пробирок | Na 2 HPO 4 (мл.) | лимонной к-ты (мл.) | смеси | р-ра яичного альбумина | спирта этилового | мутности |
| 1 | 0.25 | 0,75 | 3,2 | 0,5 | 2 | - |
| 2 | 0,34 | 0,66 | 3,7 | 0,5 | 2 | - |
| 3 | 0.41 | 0,59 | 4,2 | 0,5 | 2 | |
| 4 | 0.48 | 0,52 | 4,7 | 0,5 | 2 | - |
| 5 | 0.54 | 0,46 | 5,2 | 0,5 | 2 | |
| 6 | 0.66 | 0,34 | 5,7 | 0,5 | 2 | - |
^ ГРУППОВЫЕ РЕАКЦИИ НА УГЛЕВОДЫ
Проба с -нафтолом.
Реакция является одной из наиболее чувствительных общих реакций на углеводы и углеводные компоненты в сложных соединениях. Углеводы с -нафтолом дают фиолетовое окрашивание. Обусловлено оно тем, что при взаимодействии с концентрированной серной кислотой углеводы образуют фурфурол или 5-оксиметилфурфурол, которые конденсируются с нафтолом. Получившееся вещество окисляется в серной кислоте, образуя окрашенное хиноидное соединение.
Реакция с антроном
Фурфурол или 5-оксиметилфурфурол, образующиеся при действии серной кислоты на сахар, конденсируясь с антроном, дают соединения, окрашенные в синий или зеленый цвет.
Реакция Троммера
Реакция является пробой на редуцирующие сахара. Способностью окисляться в щелочной среде с восстановлением солей меди (II) в соли меди (I) обладают так называемые редуцирующие (восстанавливающие) моносахариды и дисахариды, содержащие в своей молекуле свободную карбонильную группу, которая при этом окисляется до карбоксильной.
Реакция Барфеда
Отличие от предыдущих реакций восстановления в том, что окисление сахароз протекает не в щелочной среде, а в среде, близкой к нейтральной. В этих условиях редуцирующие дисахариды в противоположность моносахаридам практически не окисляются, что позволяет отличить их от моноз.
Реакция Селиванова.
Реакция является пробой на кетозы 5-оксиметилферфурол, образующийся при нагревании кетогексоз с сильными кислотами (НСl), дает с резорцином вишнево- красное окрашивание. Реакцию с резорцином дают как свободные кетогексозы, так и отщепляющиеся от более сложных Сахаров (из сахарозы, например). Альдозы также могут образовывать 5-оксиметилфурфурол, но при этом требуется длительное нагревание.
Реакция на пентозы.
При нагревании с концентрированной соляной или серной кислотами пентозы теряют три молекулы воды и превращаются в фурфурол. Фурфурол - бесцветная жидкость, которая с анилином дает характерный продукт конденсации красного, с орцином - зеленого, с флороглицином - вишневого цвета.
Реакция Мальфаттн
Реакция является качественной пробой на лактозу. Химизм не ясен.
Ход работы: 1 мл исследуемого р-ра смешивают с 2 каплями NаОН и 0,5 мл аммиака. Смесь помещают на 15 мин . в водяную баню. В присутствии лактозы появляется оранжево-красное окрашивание.
Проба на сахарозу
Качественная реакция на сахарозу с солями кобальта.
Ход работы: В пробирку с 2 мл сахарозы добавляют 1 мл 5% р-ра NаОН и несколько капель 2% р-ра Со(NОз)2. Раствор приобретает фиолетовое окрашивание.
Проба на полисахарнды
При взаимодействии полисахаридов с йодом имеют место различные процессы: комплексообразованпе. адсорбция и пр. Оттенок окрашивания зависит от строения полисахарида, в частности, от степени его ветвления.
Для получения йодосорбционного соединения крахмала необходимо наличие свободного йода. NаОН превращает свободный йод в йодное, гипойодное и податное соединение, которое после прибавления кислоты разлагается с выделением свободного йода. Поэтому прежде чем приступить к йодной пробе, щелочные растворы надо нейтрализовать.
Реакция связывания свободного йода в щелочной среде:
1) J2 2NaOHNaJ NaJO H2O
2) NaJONaJO3 NaJ
В кислой среде при нейтрализации:
2NaJ Na2SO3 6HCl3J2 6NaCl 3H2
^ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ОРТО-ТОЛУИДИНОВЫМ МЕТОДОМ
Глюкоза при нагревании с о-толуиднном в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию глюкозы. Содержание глюкозы определяют в жидкости, из которой предварительно удаляют белок.
Ко всем 0,5 мл. из каждой пробирки добавить по 2 мл . орто-толуидинового реактива.
Пробирку 1` прокипятить в водяной бане в течении 8 минут.
Содержимое пробирки 1` колориметрировать на ФЭК против контрольной 2` пробы
(α = 620-640 нм ., кювета 0,5 см .)
Cоп = (Cст*Eоп)/Eоп = мг/мл
Соп – с(С6Н6О6) в исследуемой жидкости
Сст – с(С6Н6О6) в стандартной пробе
Еоп и Ест – оптическая плотность опытной и стандартной пробы
^ Тема: ЛИПИДЫ
АЦИЛГЛИЦЕРИНЫ
Акролеиновая проба
Кроме того, что жиры дают характерное масляное пятно, например, на бумаге, реакцией на присутствие жира может служить так называемая акролеиновая проба.
Акролеиновой пробой открывается в жирах остаток глицерина, который при нагревании жира частично переходит в свободный глицерин. Глицерин теряет воду и образует ненасыщенный альдегид - акролеин, легко обнаруживаемый по специфическому раздражающему запаху.
Акролеин может образовываться при пережевывании пищи, и от его присутствия в значительной мере зависит резкий, удушливый запах кухонного чада. Акролеиновую пробу проводят, нагревая жир в присутствии бисульфита калия или натрия (в качестве водоотнимающего средства). Липиды, не содержащие глицерин (воск, жирные кислоты, стерины и т.д.), акролеиновой пробы не дают.
Растворение жиров,
Обычно липиды извлекают из высушенных тканей органическими растворителями. Для разделения липидов пользуются неодинаковой растворимостью их в различных растворителях: одни из них хорошо растворимы в эфире, но плохо в ацетоне (фосфолипиды), другие растворимы в бензоле, но нерастворимы в спирте (холестерол и др.).
Эмульгирование жиров.
В виду плохой растворимости в воде липиды образуют эмульсии с бифильными молекулами - белками, детергентами, желчью.
Гидролиз жира (омыление).
Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл растительного масла и добавляют равный объем 40% р-ра едкого калия. Пробирку закрывают пробкой, в которую вставлена стеклянная трубочка (холодильник), помещают в кипящую водяную баню и держат там до образования однородного раствора мыла. Результат опыта и уравнение реакции записывают.
В пробирку наливают примерно 8-10 мл воды и взбалтывают. Полученный раствор используют для определения составных частей жира.
Открытие в гидролизате составных частей жира.
Открытие жирных кислот.
Ход работы: В пробирку наливают часть полученного в четвертом опыте гидролизата и добавляют равное количество 10 %-ного раствора серной кислоты. Пробирку опускают в кипящую водяную баню до образования на поверхности жидкости жирного слоя.
^ Открытие глицерина
Ход работы: В пробирку наливают примерно 2 мл гидролизата, добавляют 8-10 капель 10 % р-ра едкого натра и несколько капель 2% р-ра сернокислой меди. Появляется слабо-синее окрашивание, вследствие образования глицерата меди.
Результаты обеих реакций записывают.
^ Открытие ненасыщенных жирных кислот в жире.
Ход работы: В 2 пробирки наливают по 1 мл бромной воды. В первую пробирку добавляют несколько капель растительного масла и тщательно встряхивают; наблюдают обесцвечивание бромной воды. Вторая пробирка служит контролем. Результаты опыта и уравнение реакции записывают.
^
Получение нерастворимых солей высших жирных кислот
Ход работы: В пробирку наливают 1-2 мл раствора мыла (можно использовать
Гидролизат, полученный в 4 опыте) и прибавляют несколько капель 10 % р-ра хлористого кальция. Тщательно перемешивают и наблюдают появление осадка нерастворимого кальциевого мыла. Результат опыта и уравнение реакции записывают.
Определение йодного числа.
Ненасыщенность жира зависит от присутствия в его составе непредельных жирных кислот. Ненасыщенные соединения легко присоединяют по 2 атома галогена по месту каждой двойной связи. Обычно степень ненасышенности определяется йодным числом. Йодное число измеряется количеством йода, которое присоединяется к 100 г жира. Йодное число позволяет судить о степени ненасыщенности жира, о склонности его к "высыханию", прогорканию и др.
Расчет: 1 мл 0,1 н раствора гипосульфита эквивалентен 1 мл 0,1 н раствора йода или 0,0127 г йода. Зная, сколько мл 0,1 н раствора гипосульфита пошло на титрование контроля и опыта, вычисляют йодное число:
Х= (A-B)f-0,0127*100
А - количество 0,1 н р-ра гипосульфита, затраченное на титрование контроля;
В - количество 0,1 н р-ра гипосульфита, затраченное на титрование пробы;
Г- коэффициент поправки на 0,1 н р-р гипосульфита;
С - навеска жира в г.
Определение числа омыления жира.
Числом омыления называется количество мг КОН, необходимого для нейтрализации всех свободных и связанных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.
Расчет: 1 мл 0,5 н раствора КОН соответствует 25 мг КОН. Количество КОН, которое пошло на нейтрализацию всех жирных кислот 1 г жира, равно:
С= ((B-A)Г25)/a
В - количество 0,5 н р-ра НС1, затраченное на титрование контроля;
А - количество 0,5 н р-ра НС1, затраченное на титрование пробы;
А - количество жира в граммах
Г- коэффициент поправки на 0,5 н р-р НС1.
Определение кислотного числа
Кислотным числом называется число мг КОН, необходимого для нейтрализации всех свободных жирных кислот в 1 г жира.
Расчет: Количество КОН в мг, которое пошло на титрование свободных жирных кислот в 1 г жира, равняется:
С=А Г 5,6
А - количество 0,1н р-ра КОН. затраченное на титрование пробы;
Г- коэффициент поправки на 0.1 н р-р КОН;
5,6 - количество мг КОН, содержащееся в 1 мл 0,1 н р-ра КОН.
Определение эфирного числа жира.
Эфирным числом называется количество КОН, необходимое для нейтрализации жирных кислот, которые образуются при омылении 1 г жира.
Это число определяют как разницу между числом омыления данного жира и его кислотным числом.
Э = число омыления – кислотное число
^
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ НА БУМАГЕ
Этот метод широко используется для разделения смеси аминокислот, длякачественного обнаружения отдельных аминокислот. Достоинством этого метода является то, что он позволяет исследовать ничтожное количество вещества.
Разделение аминокислот основано на их различной растворимости в нескольких несмешивающихся жидкостях (фазах). Одной из жидкостей служит вода, которая прочно ассоциируется с молекулами целлюлозы и образует неподвижную фазу. Менее полярные водонасыщенные органические растворители (изобутиловый, изопропиловый, бутиловый спирт, фенол и др.) составляют подвижную фазу. Подвижный органический растворитель поднимается по полоске бумаги, растворяет нанесенные на бумагу аминокислоты и увлекает их за собой. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от степени их растворимости в подвижных и неподвижных фазах. Чем больше растворимость аминокислот в водной фазе и чем меньше ее растворимость в неводной фазе, тем медленнее движется аминокислота по сравнению с фронтом органического растворителя. Иными словами, аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (гли, лей, изо, фен, трп, вал, мет, тир), перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими боковыми цепями (про, ала, гли) или с полярными боковыми цепями (тре, глу, сер, арг, асп, гис, лиз, цис).
Положение отдельных аминокислот на хроматографической бумаге обнаруживают при помощи цветной реакции с нингидрином.
Идентификация отдельных аминокислот на хроматограмме проводят путем нанесения на ту же хроматограмму "свидетелей" - растворов отдельных аминокислот. Модно также идентифицировать аминокислоты по величине К.с равной отношению пути, пройденного аминокислотой (от места нанесения) (а) к расстоянию, пройденному растворителем (от места смеси аминокислот до фронта растворителя) (в)
Коэффициент Кс - величина, характерная для каждой аминокислоты и постоянная при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги).
Возможны разные варианты хроматографии на бумаге: нисходящая, восходящая, радиальная.
^ Ход по определению аминокислот с помощью радиальной хроматографии
1. Квадрат хромато графической фильтровальной бумаги размером 11х11 см делят диагоналями на 4 части. В центре пересечения диагоналей описывается окружность радиусом 10 –11 мм, стороны квадрата нумеруют. На середину каждой их четырех дуг, ограниченных диагоналями, наносят микропипеткой пятнышко (2-3 мм в диаметре) из аминокислот "свидетелей" и анализируемую смесь аминокислот (см. рисунок).
2. В центре квадрата иглой проделывают отверстие и в него вставляют фитиль, скатанный из небольшого треугольника фильтровальной бумаги в виде трубочки.
3. На дно чашки петри наливают 10-15 мл смеси растворителей (бутанол, уксусная кислота, вода) так, чтобы было покрыто дно чашки. Квадрат помещают на чашку Петри так, чтобы он лежал на ее краях. Фитилек должен касаться дна чашки Петри. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. По фитильку растворитель поднимается вверх, распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри (через 1 час), хроматограмму снимают, отмечают карандашом фронт растворителя, помещают ее на крышку чашки Петри и ставят в сушильный шкаф при температуре 100 - 130°С на 5 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются пятна, указывающие положение аминокислот.
4. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения R f . Аминокислоты анализируемой смеси идентифицируют, сравнивая их с Rf аминокислоты - свидетеля.
Rтир = R1см =
Rглу = R2см =
Rлей = R3 см =
^ ОБЕССОЛИВАНИЕ БЕЛКОВОГО РАСТВОРА МЕТОДОМ
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ
Низкомолекулярные вещества из белкового раствора можно достаточно быстро и полно уловить с помощью гель-фильтрации. Принцип, лежащий в основе этого метода, весьма прост. Хроматографическую колонку наполняют гелем, набухшим в воде или буферном растворе. Разделение веществ этим методом основано на различии в размерах молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул геля и выходят из колонки в первую очередь, в то время как небольшие молекулы попадают через поры гранулы, вследствие чего задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью. Метод гель-фильтрации часто называют разделением веществ по принцип молекулярного сита.
Свойствами молекулярного сита обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этих целей применяют органические полимеры с трехмерной структурой. Например, гели полисахарида декстрана (коммерческое название сефадексы). Существует несколько типов сефадексов, различающихся как размерами, так и количеством пор и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с разными размерами молекул. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше способность геля к набуханию, тем больше номер сефадекса. Для освобождения белковых растворов от солей обычно используют сефадекс марки 0-25.
^ Нанесение раствора белка. Перед нанесением раствора открывают кран на колонке и наблюдают за уменьшением столбика воды над слоем сеадекса. Как только над поверхностью геля остается слой жидкости толщиной 1-2 мм, кран закрывают и пипеткой аккуратно наносят на гель 1 мл белкового раствора, в который предварительно добавляют раствор К2СrО4 . Кран открывают и следят за проникновением раствора в гель. Снова закрывают кран, стенки колонки ополаскивают 1 мл дистиллированной воды, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают, и, стараясь не взмучивать гель, аккуратно добавляют пипеткой по стенке 4-6 мл дистиллированной воды.
^ Сбор Фракций. В 8 пробирок отмеряют по 1 мл биуретового реактива. К колонке приливают воду и открывают кран. Собирают по 10 капель в пробирки, содержащие биуретовый реактив. Наблюдают изменение окраски в порциях элюата, содержащего белок(феолетовое окрашивание).
Выход хромата калия отмечают по появлению желтого окрашивания раствора в очередной пробирке.
Гель в колонке отмывают водой до полного удаления хромата калия. После этого колонка вновь готова к употреблению.
| № пробирки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| белок | - | - | - | - | - | - | - |
|
| К2СгО4 | - | - | - | - | - |
^ ДИАЛИЗ БЕЛКА
Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 2 мл р-ра альбумина и прибавляют к раствору 1 каплю насыщенного р-ра сульфата аммония. Из листа целлофана, намоченного водой, делаю мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывают палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке должен быть ниже жидкости в стакане.
2. Через 1 час от начала диализа берут в 2 пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:
А) на присутствие SO4 добавляют в первую пробирку 3-4 капли 5 % р-ра ВаС12 и наблюдают образование осадка ВаS04 в виде белой мути.
Б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию. 3. Жидкость из мешочка сливают в пробирку (диализат), отмеряют 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.
