Определенные представления о пространственном строении и форме белковых молекул были получены в исследованиях с использованием электронного микроскопа. У многих белков форма молекул компактна и представляет шарообразные или вытянутые в виде эллипсоида частицы диаметром 10-30 нм. Другие белковые молекулы вытянуты в виде нитей диаметром 5-15 нм и длиной несколько сотен нм, третьи образуют палоч-ковидные структуры диаметром 10-20 нм и длиной 100-300 нм.
Относительная важность различных правил складывания и сборки может быть несколько иной для этих белков, чем для других - особенно длинных волокнистых белков и разновидностей, находящихся в клеточных мембранах. Действительно, недавно было показано, что некоторым крупным белкам нужна сворачивающая помощь от других белков, известных как шаперонины. Баланс статьи не будет рассматривать такие сложности, но будет целиком сосредоточен на немедленной реакции сгибания, которую испытывает большое количество белков.
Было бы замечательно, если бы исследователи имели атомный микроскоп, который мог бы снимать фильм о отдельных молекулах белка, складывающихся из их расширенного, нестабильного состояния в их конечное или родное состояние, которое является более стабильным. Из коллекции фильмов все аспекты путей реакции можно было увидеть прямо. К сожалению, такой инструмент не существует; следователи должны отказаться от гораздо менее прямых измерений и очень осторожных рассуждений. Можно найти полезные подсказки к правилам складывания, исследуя трехмерные структуры развернутых и полностью сложенных белков и анализируя свойства отдельных аминокислот и небольших пептидов.
Наиболее точные сведения о пространственном строении белков были получены методом рентгеноструктурного анализа, с помощью которого изучают структуру белковых молекул в кристаллическом состоянии. Как было выяснено, в белковых кристаллах полностью сохраняется нативная конформация молекулы, которая стабилизируется большим количеством криталлизационной воды.
К счастью, архитектура сотен нативных белков была определена такими методами визуализации, как рентгеновская кристаллография и совсем недавно ядерный магнитный резонанс. Оба метода значительно продвинулись в последнее десятилетие, как и теоретическая работа, пытающаяся математически предсказать математическое разложение с помощью компьютера. Изолированные аминокислоты состоят из центрального атома углерода, называемого альфа-углеродным связыванием с аминогруппой, карбоксильной группой и боковой цепью.
Следовательно, различия между аминокислотами обусловлены различиями в их боковых цепях, а именно по форме, размеру и полярности. Форма и размер влияют на упаковку аминокислот в конечной молекуле. Полярность определяет природу и силу взаимодействий между аминокислотами в белке и между белком и водой. Например, полярные аминокислоты сильно взаимодействуют друг с другом в так называемых электростатических взаимодействиях. Молекулы считаются полярными, если они несут формальный заряд или если они электрически нейтральны в целом, но имеют локализованные области, где преобладают положительные или отрицательные заряды.
Длинные нитевидные формы белковых молекул принято называть фибриллярными белками. Они содержат длинные параллельные полипептидные цепи, скрепленные поперечными связями (рис.12). Эти белки отличаются высокой механической прочностью и обычно выполняют структурную функцию. К фибриллярным белкам относятся коллаген сухожилий, миозин мышц, фиброин шелка, кератин волос и перьев.
Молекулы притягиваются, когда их противоположно заряженные области близки; они отталкиваются, когда близкие заряженные области близки. Электроны и протоны постоянно вибрируют, и вибрации приводят к привлекательности между веществами, которые находятся рядом друг с другом. Притяжение превращается в отталкивание, когда вещества вот-вот коснутся. В водном растворе полярные аминокислоты имеют тенденцию быть гидрофильными, они притягивают молекулы воды, которые довольно полярны. Напротив, неполярные аминокислоты, которые обычно включают боковые цепи углеводородов, имеют тенденцию быть гидрофобными: они слабо смешиваются с водой и предпочитают «связывать друг с другом».
Молекулы со сферической формой называют глобулярными белками. Их полипептидные цепи свернуты в глобулы, имеющие форму эллипсоида вращения разной степени вытянутости. К глобулярным белкам относятся ферменты, регуляторные и транспортные белки, запасные растительные белки.
Между глобулярными и фибриллярными конформациями белковых молекул имеется много переходных форм, характерных для многих белков.
В качестве альтернативы можно думать о том, что они вытесняются из воды вследствие сильного притяжения между полярными веществами. Пептидная связь, связывающая одну аминокислоту с следующей, последовательность также влияет на складку, он заметно ограничивает всевозможные конформации, которые могут быть приняты белковой основой. Пептидная связь образуется, когда карбоксильный углерод одной аминокислоты связывается с амино-азотом следующего, высвобождая молекулу воды. Полученная сильная связь между присоединенные аминокислоты, называемые остатками после их соединения, являются довольно жесткими.
В связи с большими различиями формы белковых молекул и высокой степенью их полимерности существенные трудности возникают при определении молекулярных масс белков, поэтому для этих целей разра-ботаны специальные методы исследований. Для хорошо растворимых и очищенных от примесей белков молекулярные массы могут быть опреде-лены с довольно высокой точностью по изменению осмотического давления белкового раствора. Между молекулярной массой белков и величиной осмотического давления их растворов наблюдается обратная заисимость.
Следовательно, вращение вокруг пептидной связи сильно ограничено. Действительно, атомы, расположенные между альфа-атомами углерода удерживаются в одной плоскости, так что они по существу образуют жесткую пластину. Таким образом, сгибание пептидного скелета осуществляется главным образом путем вращения пластин вокруг других связей, а именно соединений, соединяющих пластины с альфа-углеродами. Изучение особенностей денатурированных или разворачиваемых белков добавило еще другие намеки на то, как выполняется свертывание.
Развернутые или новообразованные белки часто называют случайными катушками, подразумевая, что ни одна область позвоночника существенно не отличается от любой другой области. Фактически, цепи, вероятно, никогда не будут действительно без некоторых областей, которые скручены, связаны или иначе отличаются от остальной части молекулы. Некоторые из этих подструктур, которые, вероятно, нестабильны и колеблются, вполне могут служить «семенами», вокруг которых в конечном итоге формируются устойчиво скульптурные области.
Для кристаллических форм хорошо очищенных белков молекулярные массы с высокой степенью точности определяют методом рент-геноструктурного анализа.
При определении молекулярных масс белков очень часто исполь-зуется метод седиментационного анализа, основанный на измерении ско-рости седиментации (осаждения) молекул белков под действием большой центробежной силы, возникающей при высокоскоростном центри-фугировании белкового раствора. Первая установка для высокоскоростного центрифугирования (ультрацентрифуга) была сконструирована Т. Сведбергом и Д.Б.Никольсом в 1923 г. В современных ультрацентрифугах можно создавать центробежное ускорение более 500000 g. Под действием центробежной силы молекулы белка, равномерно распределенные в растворе, начинают перемещаться с определенной скоростью в направлении действия центробежной силы, образуя удаляющуюся от центра вращения границу раздела между осаждающимися белками и чистым растворителем. Положение границы раздела через определённые промежутки времени регистрируется с помощью оптической системы и на основе этих результатов определяется коэффициент седиментации , который и выражает скорость седиментации белков.
Значительно больше известно о сложенном, чем развернутом состоянии. Например, большая часть основы компактной нативной молекулы может быть разделена на области вторичной структуры, которые представляют собой отдельные сегменты, имеющие характерные формы. Вторичные элементы подразделяются на три основные категории: спирали, бета-пряди или бета-листы и повороты, соединяющие спирали и пряди.
В бета-цепочках магистраль расширяется или растягивается; в бета-листах расположены две или более параллельные или антипараллельные нити. Другое общее правило, основанное на других анализах, устанавливает важные стерические ограничения. Конечный продукт должен быть упакован эффективно, т.е. пространство должно быть заполнено без перекрытия соседних атомов. Структурные исследования показывают, что аминокислоты в сложенных белках обычно упаковываются примерно так же сильно, как и другие небольшие органические молекулы вместе.
По мере возрастания молекулярной массы белка коэффициент се-диментации увеличивается, однако строго прямой зависимости между этими показателями не наблюдается, так как скорость седиментации зави-сит также от формы молекул.
Значение коэффициента седиментации принято выражать в специальных единицах - сведбергах , которые обозначают символом S. Один сведберг (1S) численно равен 1×10 -13 секунды. Для большинства расти-тельных белков коэффициенты седиментации находятся в пределах 1-20S.
Компьютерные моделисты могут с уверенностью предположить, что в конечном белке длины связей между атомами и углы между последовательными связями будут идентичны длинам связей, которые были обнаружены в более мелких органических молекулах. Исследователи согласны с деталями структуры сложенных белков, но они расходятся во многих других моментах. Существует, например, небольшое согласие в отношении характера и количества путей сгибания. С одной стороны, сомнительное предположение о том, что новый белок пытается найти все возможные конформации до тех пор, пока не найдет уникальную, стабильную структуру нативного белка.
На основе коэффициентов седиментации и диффузии белковых мо-лекул рассчитаны молекулярные массы многих белков, выделенных из различных объектов:
рибонуклеаза 12640 α-амилаза 97600
гемоглобин 64500 каталаза 247500
глиадин пшеницы 27500 эдестин конопли 300000
альбумин яйца 44000 уреаза сои 483000
зеин кукурузы 50000 пепсин 35500
Для определения молекулярных масс полипептидов, входящих в состав олигомерных белков, находит широкое применение метод электро-фореза заряженных частиц в полиакриламидном геле, который позволяет проводить очень точное разделение полипептидов под воздействием электрического поля.
В этом предложении предполагается, что все конформации будут в равной степени проверены; но это не так. Кроме того, как указывалось много лет назад Киром Левинталем, затем в Массачусетском технологическом институте, никакая молекула не имела бы возможности проверять где-либо около всех возможных конформаций за время, необходимое для сгибания белков - не более нескольких секунд. С другой стороны, существует понятие, что белки следуют одному определенному пути: каждая молекула данного белка уплотняется, следуя одной определенной последовательности шагов.
Под влиянием электрического поля заряженные молекулы полипеп-тидов движутся к аноду или катоду через пористый носитель, которым является полиакриламидный гель, образующийся при совместной полиме-ризации акриламида и бисакриламида в определенной буферной среде. Этот гель сильно гидратирован и имеет поры определенных размеров в зависимости от соотношения акриламида и бисакриламида. Скорость дви-жения заряженных частиц в пористом носителе зависит от величины заряда, молекулярной массы и пространственной конфигурации молекул, поэтому в результате электрофореза разделяемые частицы, различающиеся по электрическому заряду и пространственным параметрам, распреде-ляются в полиакриламидном геле в виде узких зон, которые окрашиваются специальным красителем. Размеры окрашенных зон точно указывают концентрацию выделенных при электрофорезе полипептидов, а их общее число - наличие в изучаемой смеси разных полипептидов (рис . 13).
Учитывая большое количество конформаций, которые может принять развернутая молекула, эта идея кажется невероятной. Эта гипотеза сродни тому, что все будут входить в Нью-Йорк через Межгосударственный 95, независимо от того, где они начинаются. Третье предположение, которое допускает один или несколько путей, предполагает, что гидрофобный эффект все-таки важен вначале, намного больше, чем электростатическое взаимодействие или проблемы с заполнением пространства. Эта идея гласит, что цепь быстро разрушается примерно до конечной плотности для удаления гидрофобных аминокислот из воды.
Белковая молекула имеет четыре типа структурной организации – первичная, вторичная, третичная и четвертичная.
Линейная структура, представляющая собой строго определенную генетически обусловленную последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Основной вид связи – пептидная (механизм образования и характеристика пептидной связи рассмотрены выше).
Затем в этом значительно сокращенном пространстве он быстро реорганизуется в правильные вторичные и третичные структуры. С механической точки зрения этот сценарий кажется маловероятным, потому что цепочка должна была бы открыться несколько, чтобы разрешить необходимые движения. Тем не менее, модель имеет некоторую экспериментальную поддержку. Наилучшая догадка заключается в том, что вторичная структура образуется до того, как большинство белков могут интенсивно сокращаться. Молекулы одного и того же белка могут следовать различным путям к одному и тому же концу, но выбор пути ограничен.
Полипептидная цепь обладает значительной гибкостью и в результате внутри цепочечных взаимодействий приобретает определенную пространственную структуру (конформацию).
В белках различают два уровня конформации пептидных цепей – вторичную и третичную структуры.
Это укладка полипептидной цепи в упорядоченную структуру благодаря образованию водородных связей между атомами пептидных групп одной полипептидной цепи или смежных цепей.
Кима, ныне в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда. В целом, такие модели предполагают, что развернутая цепь быстро формирует незначительно стабильные биты вторичной структуры. Некоторые из этих сегментов взаимодействуют. Если они упаковываются вместе особенно хорошо или образуют облигации легко, они стабилизируют друг друга, по крайней мере на какое-то время. Стабилизированные единицы или микродомены приводят молекулу к большей структурной организации, связывая ее с другими сегментами или помогают связать отдаленные сегменты или и то, и другое.
При формировании вторичной структуры водородные связи образуются между атомами кислорода и водорода пептидных групп:
По конфигурации вторичная структура делится на два типа:
спиральные (α-спираль)
слоистоскладчатые (β-структура и кросс- β-форма).
α-Спираль имеет вид регулярной спирали. Формируется благодаря межпептидным водородным связям в пределах одной полипетидной цепи (рис. 1).
В основе такого типа модели лежит предположение о том, что гидрофобный эффект является большим, но может быть затрачен постепенно. Часть его энергии расходуется, чтобы влиять на формирование вторичных элементов, а остальная часть способствует объединению этих элементов в третичную конформацию. Знание чего-то о структурах, которые неоднократно появляются на пути к родному состоянию, поможет прояснить правила складывания. К сожалению, улавливание промежуточных продуктов затруднено, отчасти потому, что складывание - это процесс с высокой степенью кооперации.
Рис. 1. Схема формирования α-спирали
Основные характеристики α-спирали:
– водородные связи образуются между пептидными группами каждого первого и четвертого аминокислотного остатка;
– витки спирали регулярны, на один виток приходится 3,6 аминокислотных остатков;
Взаимодействия, которые способствуют сгибанию одной частью белка, также способствуют свертыванию в другом месте молекулы; следовательно, промежуточные формы не сохраняются долго. Методы, умные методы захватили или идентифицировали некоторые характеристики ряда промежуточных соединений. В настоящее время существуют убедительные доказательства того, что некоторые белки образуют промежуточное вещество, которое больше, чем нативная форма белка, и имеет вторичную структуру.
Олег Птицын из Института химии белков в Пущино в Советском Союзе называет эту структуру «расплавленной глобулой». Однако существование такой структуры вызывает недоумение. Это последовательность аминокислот. В некоторых белках линейная полипептидная цепь сшита: дисульфидные связи. Первичная структура представляет собой полипептид, в котором.
– боковые радикалы аминокислот не участвуют в образовании α-спирали;
– в образовании водородной связи участвуют все пептидные группы, что обуславливает максимальную стабильность α-спирали;
– поскольку все атомы кислорода и водорода пептидных групп вовлечены в образование водородных связей, то это приводит к снижению гидрофильности α-спиральных областей;
Каждая аминокислота в пептиде представляет собой остаток. существует регулярно повторяющийся сегмент, называемый основной цепью или основой, и переменная часть, состоящая из боковой цепи. Первичная структура белка представляет собой линейный полимер с рядом аминокислот. Образование пептидных связей создает молекулы воды в качестве побочного продукта, когда аминоконцевой остаток теряет кислород из альфа-карбоксильной группы, тогда как другая аминокислота теряет два своих атома водорода из его альфа-аминогруппы.
Таким образом, полипептид или полипептидная цепь представляет собой термин, который описывает множественные связные пептидные связи между многочисленными аминокислотами. Каждая аминокислота в полипептидной цепи представляет собой единицу, обычно известную как остаток. Эти цепочки имеют планарный скелет, поскольку пептидные связи имеют характеристики двойной связи из-за существования резонанса между карбонильным углеродом и азотом, где образуются пептидные связи. Первичная структура каждого белка была точно определена конкретными генами.
– α-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией полипетидной цепи, отвечающей минимуму свободной энергии;
– препятствуют образованию α-спирали пролин и оксипролин – в местах их расположения регулярность α-спирали нарушается и полипептидная цепь легко изгибается (ломается), так как не удерживается второй водородной связью (рис.2).
Рис. 2. Нарушения регулярности α-спирали
Атом азота α-иминогруппы пролина при образовании пептидной связи остается без атома водорода, следовательно не может участвовать в образовании водородной связи. Много пролина и оксипролина в полипептидной цепи коллагена (см. классификацию простых белков – коллаген).
Высокая частота α-спирали характерна для миоглобина и глобина (белок, входящий в состав гемоглобина). В среднем глобулярные (округлые или эллипсовидные) белки имеют степень спирализации 60–70 %. Спирализованные участки чередуются с хаотическими клубками. В результате денатурации белка переходы спираль → клубок увеличиваются. На спирализацию (формирование α-спирали) влияют радикалы аминокислот, входящие в состав полипептидной цепи, например, отрицательно заряженные группы радикалов глутаминовых кислот, расположенные вблизи друг от друга, они отталкиваются и препятствуют образованию α-спирали (образуется клубок). По той же причине препятствуют образованию α-спирали близко расположенные аргинин и лизин, имеющие положительно заряженные функциональные группы в радикалах (см. пример протамины и гистоны).
Препятствуют формированию α-спирали также большие размеры радикалов аминокислот (например, радикалы серина, треонина, лейцина).
Таким образом, содержание α-спиралей в белках неодинаково.
β-Структура (слоисто-складчатая) – имеет слабо изогнутую конфигурацию полипептидной цепи и формируется с помощью межпептидных водородных связей в пределах отдельных участков одной полипептидной цепи или смежных полипептидных цепей. Различают две разновидности β-структуры:
– к росс-β-форма (короткая β-структура) – представляет собой ограниченные слоистые участки, образованные одной полипептидной цепью белка (рис. 3).
Рис. 3. Кросс-β-форма белковой молекулы
Большинство глобулярных белков включают короткие β-структуры (слоистые участки). Их состав может быть представлен следующим образом: (αα), (αβ), (βα), (αβα), (βαβ).
– полная β-структура . Этот тип характерен для всей полипептидной цепи, которая имеет вытянутую форму и удерживается межпептидными водородными связями между смежными параллельными или антипараллельными полипептидными цепями (рис. 4).
Рис. 4. Полная β-структура
В антипараллельных структурах связи более стабильны, чем в параллельных.
Белки с регулярной β-структурой более прочные, плохо или совсем не перевариваются в желудочно-кишечном тракте.
Формирование вторичной структуры (α-спирали или β-структуры) обусловлено последовательностью аминокислотных остатков в полипептидной цепи (т.е. первичной структурой белка) и, следовательно, генетически предопределено. Благоприятствуют образованию β-структуры такие аминокислоты как метионин, валин, изолейцин и аспарагиновая кислота.
Белки с полной β-структурой имеют фибриллярную (нитевидную) форму. Полная β-структура встречается в белках опорных тканей (сухожилий, кожи, костей, хрящей и др.), в кератине (белок волос и шерсти) (характеристику отдельных белков см. в разделе «Белки пищевого сырья»).
Однако не все фибриллярные белки имеют только β-структуру. Например, α-кератин и парамиозин (белок запирательной мышцы моллюска), тропомиозин (белок скелетных мышц) – относятся к фибриллярным белкам а вторичная структура у них – α-спираль.
